EISEN. Chudinova, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elansky
Viru kuerzem gouf gewisen datt den Ascomycete Pilz Ilyonectria crassa fäeg ass d'Kartoffelknollen z'attackéieren. Dës Aarbecht war déi éischt fir d'biologesch Charakteristiken an d'Resistenz géint verschidde Fungiziden vun der I. crassa-Stamm ze analyséieren, isoléiert vu Gromperen. D'Sequenzen vun Speziesspezifesch Regiounen vun der "Kartoffel" Stamm sinn zesummegefall mat deenen, déi virdru fir Pilze isoléiert goufen aus de Wuerzelen vum Narzissus, Ginseng, Aspen a Bich, Lilie Knollen an Tulpeblieder. Anscheinend kënne vill Wëld a Gaart Planzen Reserven fir I. crassa sinn. De studéierte Stamm infizéiert Scheiwen vun Tomaten a Kartoffel, awer huet net eng ganz Tomate Fruucht oder en intakt Kartoffelknollen infizéiert. Dëst weist datt I. crassa e Woundparasit ass. Evaluatioun vu Resistenz géint Fludioxonil, Difenoconazol an Azoxystrobin op engem Nährstoffmedium huet déi héich Effektivitéit vun dësen Drogen gewisen.
Den EC50 Indikator (Fungizid Konzentratioun déi verlangsamt ëm 2 Mol den Taux vum radial Wuesstum vun der Kolonie relativ zu der Net-Fungizid Kontroll) war gläich wéi 0.4; 7.4 a 4 mg/l respektiv. D'Méiglechkeet fir eng Krankheet ze entwéckelen, déi duerch I. crassa verursaacht gëtt, sollt berücksichtegt ginn wann Dir phytopathologesch Kartoffelknollen an d'Entwécklung vu Planzeschutzmoossnamen beurteelt.
D'Entwécklung vu phytopathogenen Mikroorganismen féiert zu héije Verloschter an all Stadium vun der Kartoffelkultivatioun a Lagerung. Beim Planung vu Schutzmoossnamen, an der Regel, sinn bekannte Pathogenen berücksichtegt, wéi Arten vun der Genera Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora, etc. iwwer d'Erscheinung vun neie phytopathogene Mikroorganismen op Kartoffel. Hir Biologie ass schlecht studéiert, d'Effektivitéit vu Fungiziden, déi op Kartoffel géint si benotzt ginn, ass onbekannt, an diagnostesch Methoden sinn net entwéckelt. Wann en masse entwéckelt, si si fäeg fir e wesentleche Schued un der Kartoffelkultur ze verursaachen. Ee vun dëse Mikroorganismen ass den Ascomycete Pilz Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, fir d'éischt vun den Auteuren op Kartoffelknollen entdeckt (Chudinova et al., 2019).
Dëse Pabeier presentéiert d'Resultater vun enger Analyse vum I. crassa Stamm, deen aus enger Kartoffelknollen isoléiert ass. D'Morphologie vu Kolonien a mycelial Strukturen vun I. crassa, Nukleotid Sequenzen vun Spezies-spezifesch DNA Rubriken, Virulence zu Gromperen an Tomaten, a Resistenz zu e puer populär Fungiziden goufen studéiert.
Material a Methoden
De Stamm, deen an dëser Aarbecht benotzt gëtt, ass I. crassa 18KSuPT2, isoléiert am Joer 2018 vun enger infizéierter Kartoffelknollen, déi an der Kostroma Regioun ugebaut ass. De Knollen ass duerch dréchenem Rot beaflosst mat engem Huelraum, deen mat hellbraune Myselium bedeckt ass. Mat enger steriler Dissektiounsnadel gouf de Pilzmyselium an e Petri-Schuel mat engem Agarmedium (Béierwort 10%, Agar 1.5%, Penicillin 1000 Unitéiten /ml) transferéiert. D'Platen goufen am Däischteren bei 24 ° C inkubéiert.
Fir Fotografie, Bewäertung vun der Gréisst an der Morphologie vu Spore a Sporulatiounsorganer, goufen e Leica DM2500 Liichtmikroskop mat enger ICC50 HD Digitalkamera an e Leica M80 Binokularmikroskop mat enger IC80HD Digitalkamera (Leica Microsystems, Däitschland) benotzt.
Fir d'DNA ze isoléieren, gouf de Pilzmyselium a flëssege Ierbsmedium ugebaut, duerno a flëssege Stickstoff gefruer, homogeniséiert, an CTAB-Puffer inkubéiert, mat Chloroform gereinegt an zweemol mat 2% Alkohol gewascht.
D'DNA-Extraktiounsmethod gëtt am Detail am Artikel vum Kutuzova et al. (2017).
Fir Artenidentitéit duerch molekulare Methoden a Verglach mat anere bekannte Stämme vun I. crassa ze bestëmmen, gouf PCR mat Primer gemaach, déi d'Verstäerkung vun Aartspezifesche DNA Regiounen erlaabt hunn: ITS1-5,8S-ITS2 (primers ITS5/ITS4, White et al., 1990), Regioune vu b Genen -tubulin (Bt2a/Bt2b, Glass an Donaldson, 1995) an Iwwersetzungsverlängerungsfaktor 1α (tef1α) (Primeren EF1-728F/EF1-986R, Carbone a Kohn, 1999). Amplicone vun der erfuerderter Längt goufen aus dem Gel extrahéiert mat dem CleanUp Kit vun Evrogen. Déi amplifizéiert Regioune goufen sequentéiert mat dem BigDye®Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA) op engem Applied Biosystems 3730 xl automatiséierte Sequenzer (Applied Biosystems, CA, USA). Déi kritt Nukleotid Sequenzen goufen benotzt fir e Match an der GenBank Datebank vum US National Center for Biotechnology Information (NCBI) ze sichen. Phylogenetesch Analyse gouf mam MEGA 6 Programm gemaach (Tamura et al., 2013).
D'Bestëmmung vu Virulenz gouf op ganz gréng Fruucht vu grousser Fruucht Tomaten (Varietéit Dubrava) a Kartoffelknollen (Varietéit Gala) duerchgefouert. Zousätzlech, fir Schied un beschiedegt Uebst a Knollen ze simuléieren, goufen Scheiwen vun der selwechter Uebst a Knollen benotzt. Knollen Scheiwen goufen an fiichten Chambers geluecht, déi Petri Platen mat naass Filter Pabeier um ënnen waren. E Glas Rutsch gouf op de Pabeier geluecht, op deem, am Tour, Scheiwen vu Knollen oder Uebst geluecht goufen. Ganz Knollen an Uebst goufen och an Containeren mat naass Filterpabeier um Buedem geluecht. E Stéck Agar (5 × 5 mm) mat Pilzhyphae gouf am Zentrum vun der Scheiwen (oder op der intakt Uewerfläch vum Knollen oder Fruucht) mat Pilzhyphae no 5 Deeg Kultivatioun op Wort Agar geluecht.
D'Resistenz vu Pilzstämme géint Fungiziden gouf a Laboratoirebedéngungen op engem Agar Nährstoffmedium bewäert. Mir studéiert d'Sensibilitéit fir d'fungizid Medikamenter Maxim, KS (aktiv Zutat Fludioxonil, 25 g/l), Quadris, KS (azoxystrobin 250 g/l), Skor, CE (Difenoconazol 250 g/l) (Staatskatalog..., 2020) ). D'Evaluatioun gouf an Petri Platen op Wort-Agar Medium mat der Zousatz vun den studéierten Drogen bei enger Konzentratioun vun der aktiver Substanz vun 0.1 gemaach; 1; 10 ppm (mg/l) (fir Fludioxonil an Difenoconazol), 1; 10; 100 ppm (fir Azoxystrobin) an op engem Medium ouni Fungizid (Kontroll). De Fungizid gouf an d'Schmelz bäigefüügt an op 60 °C Medium ofgekillt, duerno gouf d'Mëttel an Petri Platen gegoss. En Agarblock mat Pilzmyselium gouf am Zentrum vun engem Petri-Schale plazéiert a bei enger Temperatur vu 24 °C am Däischteren kultivéiert. No 7 Deeg Inkubatioun goufen d'Duerchmiesser vun de Kolonien an zwou senkrecht Richtungen gemooss; d'Miessresultater fir all Kolonie waren duerchschnëttlech. Experimenter goufen an triplicate gemaach. Baséierend op den Testresultater gouf den EC50 Index berechent, gläich wéi d'Fungizidkonzentratioun, déi den Taux vum radiale Wuesstum vun der Kolonie par rapport zu der Net-Fungizid Kontroll halbéiert huet.
Resultater an Diskussioun
Op Petri Platen mat Wort Agar huet de Pilz Kolonien mat wäisse flaache Myselium geformt. De Medium ënner dem Myselium gouf rout-brong. Wann d'Mëttel getrocknt huet, huet de Pilz zwou Zorte vu Spore op eenzel Konidiophore geformt an déi a kleng Sporodochien aggregéiert. Macroconidia sinn verlängert, zylindresch, mat engem bis dräi Septa, duerchschnëttlech Längt 27.2 µm mat enger Rei vu Wäerter vun 23.2 bis 32.2 µm, Breet - bis zu 4.9 µm (Fig. 1). D'Duerchschnëttslängt vu Mikrokonidien ass 14.3 µm mat enger Rei vu Wäerter vun 10.3 bis 18.1 µm, Breet - bis zu 4.0 µm. All makro- a mikromorphologesch Charaktere falen am Variatiounsberäich vun der Spezies Ilyonectria crassa (Cabral et al., 2012).
D'Sequenze vun Aartspezifesch DNA Regiounen (ITS, b-Tubulin, TEF 1α) ware komplett mat de Sequenzen vun den I. crassa Stämme zesummegefall, déi mir virdru studéiert hunn (Chudinova et al., 2019, Table 1). Fir d'Prévalence vun I. crassa an anere Regiounen ze studéieren an de Spektrum vun betroffenen Kulturen ze analyséieren, goufen ähnlech DNA Sequenzen an der GenBank Datebank (Table 1) analyséiert. D'Iwwerlappung gounge vun 86 bis 100%. D'Sequenzen vun allen dräi DNA Regioune vun der "Kartoffel" Stamm vun I. crassa waren identesch mat de Sequenze vu Stämme isoléiert vu Lilie Knollen an Narzisswurzelen an Holland a vu Ginsengwurzel a Kanada. Mir konnten keng aner I. crassa Stämme mat den dräi analyséiert ähnlechen Sequenzen an oppenen Datenbanken fannen. Wéi och ëmmer, d'Analyse vun deponéierten ITS a b-Tubulin Sequenzen huet d'Präsenz vun I. crassa op Tulpeblieder a Groussbritannien opgedeckt. Fungi mat enger ähnlecher ITS Sequenz goufen identifizéiert wann Dir d'Mykobiota vun Aspenwurzelen a Kanada a Bich an Italien analyséiert, a Kartoffelknollen a Saudi Arabien (Table 1). D'Resultater vun dëser Etude weisen datt I. crassa eng global Verdeelung huet a fäeg ass verschidde Planzenaarten z'attackéieren.
Bei der Bestëmmung vun der Pathogenizitéit op Tomaten a Kartoffelscheiwen am Dag 5, erreecht den Duerchmiesser vun der Läsion 1.5 cm Zur selwechter Zäit huet de studéierte Stamm net eng ganz Tomate Fruucht oder eng intakt Kartoffelknollen infizéiert. Wéi och ëmmer, Schied un de Sepalen gouf op Tomate beobachtet. Fir d'Méiglechkeet vu Kontaminatioun auszeschléissen, gouf e Pilzisolat an eng reng Kultur aus dem Myselium isoléiert, deen op enger Scheif vu Kartoffelknollen entwéckelt gouf. Et war komplett identesch mat der Elterenstamm. I. crassa schéngt e Woundparasit ze sinn.
Pre-Planzung Behandlung vu Somen Knollen mat Fungiziden kann d'Entwécklung vu Krankheeten op Planzen während der wuessender Saison reduzéieren. Fir effektiv Fungiziden ze wielen, ass et wichteg ze evaluéieren, wéi eng effektiv géint I. crassa sinn. D'Aarbecht studéiert wäit benotzt aktiv Zutate vu Fungiziden - Fludioxonil, Azoxystrobin, Difenoconazol. Fludioxonil ass Deel vu verschiddene gemëschte Preparatiounen, déi benotzt gi fir Somen a Somenknollen ze behandelen ier Planzung. Fludioxonil (Maxim) gëtt och benotzt fir Somenknollen ze behandelen ier se gespäichert ginn. Difenoconazol an Azoxystrobin sinn och an enger Zuel vu Preparatiounen abegraff, déi fir d'Veraarbechtung vu Sommaterial benotzt ginn, souwéi a Preparatiounen, déi fir d'Veraarbechtung vu vegetative Planzen geduecht sinn (Staatskatalog ..., 2020).
De Wuesstem Taux vun I. crassa war op Medien studéiert (Figebam. 2) mat verschiddene Konzentratioune vun aktiv Zutate: Fludioxonil (EC50 = 0.4 ppm), azoxystrobin (EC50 = 4 ppm) an difenoconazole (EC50 = 7.4 ppm) (Table 2) . Dës Medikamenter kënnen als héich effektiv géint I. crassa ugesi ginn, well hiren EC50 wesentlech méi niddereg ass wéi d'recommandéiert Konzentratioun vum Medikament an der Aarbechtsflëssegkeet déi benotzt gëtt fir Knollen ze behandelen. Laut dem Staatskatalog ... (2020) läit d'Konzentratioun vu Fludioxonil an der Flëssegkeet fir d'Behandlung vu Kartoffelknollen vu 500 bis 1000 ppm, Azoxystrobin (an der Flëssegkeet fir d'Behandlung vum Buedem vum Furrow) - 3750-9375 ppm, Difenoconazol (an der Flëssegkeet fir d'Behandlung vu vegetative Planzen) - 187.5-625 ppm.
Table 1. Sequenz Ähnlechkeet tëscht Spezifesch Sequenzen vum Stamm 18KSuPT2 an Ilyonectria crassa Stämme verfügbar an der Genbank Datebank
Sträich | Gaaschtplanz, Plaz vun der Ausscheedung | Sequenznummeren deposéiert an GenBank, Prozentsaz vun Ähnlechkeeten | Link | ||
SINN | β-Tubulin | TEF 1α | |||
17KSPT1 an 18KSuPT2 | Kartoffelknollen, Kostroma Regioun. | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et al., 2019 |
CBS 158/31 | Narcissus Wuerzelen, Holland | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral et al., 2012 |
CBS 139/30 | Lily Bulb, Holland | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Ginseng Wuerzel, Kanada | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735/725 99.6 |
|
RHS 235138 | Tulip Leaf, UK | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | Denton, Denton, 2014 |
MT294410 | Aspen Wuerzelen, Kanada | MT294410 100 | ND | ND | Ramsfield et al., 2020 |
ER1937 | Buc, Italien | KR019363 99.65 | ND | ND | Tizzani, Haegi, Motta. Direkt Soumissioun |
KAUF 19 | Potato tuber, Saudi Arabien | HE649390 98.3 | ND | ND | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = net deposéiert
Dësch 2. Resistenz vun Ilyonectria crassa zu Fungiziden
(aktiv Substanz) | EC 50, ppm | ||||
3 Dag | 5 Dag | 7 Dag | |||
Kontrollen | 17 ± 2 | 33 ± 5 | 47 ± 3 | ||
Quadris, KS (fzoxystrobin) | 18 ± 1 | 34 ± 2 | 48 ± 2 | ||
11 ± 1 | 11 ± 1 | 12 ± 1 | |||
11 ± 1 | 11 ± 1 | 12 ± 1 | |||
Maxim, KS (fludioxonil) | 16 ± 1 | 28 ± 2 | 48 ± 2 | ||
7 ± 1 | 13 ± 3 | 19 ± 4 | |||
5 ± 1 | 12 ± 1 | 17 ± 5 | |||
Score, EC (Difenoconazol) | 18 ± 1 | 35 ± 2 | 48 ± 1 | ||
11 ± 1 | 24 ± 3 | 35 ± 4 | |||
11 ± 1 | 13 ± 1 | 17 ± 3 |
An eiser Aarbecht goufen I. crassa Stämme vu Kartoffelknollen an de Kostroma a Moskau Regiounen isoléiert (Chudinova et al., 2019). En héijen Undeel vu Pilzstämme mat ITS Sequenzen identesch mat I. crassa gouf identifizéiert wann d'Mykobiota vu Kartoffelknollen a Saudi Arabien analyséiert gouf (Gashgari a Gherbawy, 2013). Anscheinend ass I. crassa net sou rar op Gromperen wéi et schéngt. Eis Experimenter hu gewisen datt de Pilz beschiedegt Tomatenfrüchte kéint infizéieren. Et ass aus der Literatur bekannt datt I. crassa fäeg ass sech am Buedem saprotrophesch z'entwéckelen (Moll et al., 2016), an och eng grouss Varietéit vu Planzen infizéieren, och déi sou wäit an taxonomesche Begrëffer wéi Narzissen, Lilies, Ginseng, Aspen a Buche (Table 1). Anscheinend kënne vill Wëld a Gaart Planzen Reserven fir I. crassa sinn. Déi uewe weist datt wann Dir Schutzmoossnamen entwéckelt, et néideg ass d'Méiglechkeet vu Schued vu Kartoffelknollen duerch dëse Pilz ze berücksichtegen. Breet benotzte Virbereedungen fir d'Behandlung vu Kartoffelknollen, déi Fludioxonil, Azoxystrobin an Difenoconazol enthalen, hunn eng héich fungizidal Effektivitéit géint I. crassa gewisen.
D'Aarbecht gouf vun der russescher Fondatioun fir Grondfuerschung ënnerstëtzt (Subventioun Nr. 20-016-00139).
Den Artikel gouf am Journal "Bulletin of Plant Protection", 2020, 103(3) publizéiert.